水中的腸球菌也被稱為革蘭陽性球菌，此類菌種廣泛的分布于自然環(huán)境及人、動(dòng)物等消化道內(nèi)。因此在常見的地表水也有此類菌種的存在，目前針對腸球菌的檢測可以采用很多方法，例如常用的平板計(jì)數(shù)法、最近似值測定法以及酶底物法。而今天我們要了解的就是利用酶底物法檢測飲用水中腸球菌的具體步驟。

  其原理是腸球菌在41℃溫度條件下培養(yǎng)24h，能夠產(chǎn)生β-D-葡糖苷酶，將選擇性培養(yǎng)基中熒光底物4-甲基傘形酮β-D-葡糖苷（4-MUG）分解，分解后的熒光底物在366nm紫外光下產(chǎn)生熒光，統(tǒng)計(jì)陽性反應(yīng)數(shù)量，通過查詢MPN表，計(jì)算樣品中的腸球菌濃度。

檢測試劑及材料

1.市售Enterolert 培養(yǎng)基，也可以使用其他等效產(chǎn)品。

2. 生理鹽水:氯化鈉濃度為0.85%。

3.標(biāo)準(zhǔn)菌株:糞腸球菌有證標(biāo)準(zhǔn)菌株，大廠埃希氏菌有證標(biāo)準(zhǔn)菌株。

4.無菌水:實(shí)驗(yàn)室一級純水，經(jīng)121℃高壓蒸氣滅菌20min。

5.硫代硫酸鈉:純度≥98%。

6.硫代硫酸鈉溶液(5.0g/L)

稱取0.5g硫代硫酸鈉，精確至0.1g，溶于適量水中，定容至100mL，121℃高壓滅菌20min。

7.磷酸鹽緩沖液:

氯化鈉                8.01g

氯化鉀                0.2g

磷酸氫二鈉            1.44g

磷酸二氫鉀            0.24g

上述成分溶解于950mL無菌水中，用鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH值到7.4后加無菌水定容至1000mL，121℃高壓滅菌20min，備用。

檢測儀器

1.采樣瓶:具螺旋蓋或磨口塞的100mL、500mL玻璃瓶。

2.恒溫培養(yǎng)箱:允許溫度偏差41℃±1℃。

3.高壓蒸汽滅菌器:121℃可調(diào)。

4.程控定量封口機(jī):用于定量盤的封口。

5.紫外燈及配套燈箱:366nm。

6.定量盤:51孔或97孔。

7.天平:精確至0.001g。

8.容量瓶:10mL和100mL。

檢測步驟

首先是定性分析

  用滅菌處理過的100mL采樣瓶量取100mL水樣，加入一包培養(yǎng)基，混搖均勻使之完全溶解，放入恒溫培養(yǎng)箱中41℃±1℃培養(yǎng)24h。

其次是定量分析

  用滅菌處理過的100mL采樣瓶量取100mL水樣，加入一包培養(yǎng)基，混搖均勻使之完全溶解。

  將上述100mL水樣全部倒入51孔無菌定量盤內(nèi)，撫平定量盤背面以趕除孔穴內(nèi)氣泡，然后用程控定量封口機(jī)封口，放入恒溫培養(yǎng)箱中41℃±1℃培養(yǎng)24h。

  空白對照可以用無菌水按照檢測步驟進(jìn)行操作。

定性結(jié)果

  定性分析的水樣，在紫外燈下觀察，產(chǎn)生熒光，則判定為陽性反應(yīng)；不產(chǎn)生熒光則判定為陰性反應(yīng)。

定量結(jié)果

  在紫外燈下觀察培養(yǎng)24h定量盤，計(jì)數(shù)有熒光反應(yīng)的孔數(shù)，參照可信范圍表計(jì)數(shù)定量，結(jié)果以MPN/100mL表示。如所有孔穴均未產(chǎn)生熒光，則報(bào)告腸球菌“未檢出”。若熒光不明顯，可以延長培養(yǎng)時(shí)間至28h進(jìn)行結(jié)果判讀，超過28h后出現(xiàn)的顏色反應(yīng)，不作為陽性結(jié)果。